Вестерн-блоттинг

Детекция белков

Обнаружение определенного типа белка – довольно часто возникающая перед исследователями задача. Для детекции белка существует множество различных способов, выбор конкретного метода зависит от цели исследования, количества определяемого белка и др. Ниже мы рассмотрим самые основные из них.

Вестерн-блоттинг — аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген-антитело». С помощью гель-электрофореза белки разделяются в полиакриламидном геле. Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану. Затем их детектируют с использованием антител методом «сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые в свою очередь связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами. Визуализация исследуемого белка достигается путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяется колориметрическим, хемилюминесцентным, флюоресцентным методами детекции. 

Однако выполнение всех перечисленных выше операций вручную является довольно долгим и трудоемким процессом. Существование приборов, в которых выполнение этих операций полностью или частично автоматизировано, значительно упрощает жизнь исследователю. Все приборы для блоттинга можно подразделить на несколько групп, в зависимости от того, какой тип переноса используется в них.

Иммуноферментный анализ (ИФА или ELISA) так же является одним из очень популярных методов детекции белков. ИФА — это лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.

Вестерн-блоттинг без труда - iBind Western Device и iBind Flex Western Device

Все, что Вам понадобится для использования устройств iBind:

  • устройство iBindTM Western Device или Western Flex Device
  • 1 упаковка карт iBindTM Cards или iBind Flex Cards (10/box)
  • набор iBind Solution Kit iBind Flex Western Device

Экономия времени

  • Сокращает время длительных ночных инкубаций антител на ~2,5 часов
  • Время установки всего 15 минут

Простота в использовании

  • После того как Вы помещаете свои растворы в прибор iBindTM, Вашего участия в процессе больше не требуется
  • Все шаги связывания антител и отмывки проходят автоматически
  • Последовательный латеральный поток контролирует высвобождение каждого антитела и промывочных растворов
  • Совместимость с HRP- и AP- конъюгированными антителами

Приборы iBind - это автоматизированное оборудование для вестерн-блоттинга. Они не требует участия оператора, обеспечивают воспроизводимые результаты, быстро работают и совместимы с протоколами для вестерн-блота. Блокирование, первичное и вторичное связывание антител и все этапы отмывки проходят автоматически за счет технологии последовательного латерального потока (SLF). Таким образом приборы iBindTM обеспечивают полную автоматизацию процесса, а также высокую его чувствительность и воспроизводимость по сравнению с традиционными методами вестерн-блота.

iBind Western Device

Принцип работы приборов iBind

В приборах iBind реализована SLF технология последовательного латерального потока, за счет которой автоматически происходит блокирование, первичное и вторичное связывание антител и все этапы отмывки. Технология последовательного латерального потока обеспечивает своевременную доставку первичных и вторичных антител за счет механического давления, оказываемого на карту iBindTM Card. Стекловолокно в карте iBind TM Card позволяет антителам и промывочным растворам поступать на вестерн-мембрану с постоянной скоростью. Абсорбирующий блок, прикрепленный к одному из концов iBindTM Card, оттягивает ток жидкости, распространяя её по карте и по мембране. Приборы iBindTM Western Device и iBind Flex Western Device обеспечивают полную автоматизацию процесса. Сравнение их работы с традиционными методами вестерн-блота, показало большую чувствительность и воспроизводимость вестерн-блота на приборе iBind по сравнению с традиционными методами.

Рисунок 1.
Вестерн-блоты, полученные с помощью системы iBind TM демонстрируют повышенную чувствительность по сравнению с вестерн-блотами, полученными вручную. (A-B) Вестерн-блоты с фосфорилированным Akt (слева направо: клеточный экстракт 30 мкг - 500 нг) были получены на системе iBind TM и вручную по стандартным протоколам для вестерн-блота, рекомендованным производителем антител (первичные моноклональные антитела к фосфорилированным Akt [Thr308] [C31E5E]; вторичные кроличьи антитела конъюгированные с HRP). На вестерн-блоте, полученном с помощью iBindTM, фосфопротеинкиназа В была выявлена в 500 нг клеточного экстракта, тогда как на блоте, сделанном вручную, она была выявлена только в 4 мкг экстракта. [C-D] Вестерн-блоты лизата, экспрессирующего CREB (слева направо: клеточный лизат 30 мкг - 1 мкг) были проведены на системе iBindTM и вручную по стандартным протоколам для вестерн-блота, рекомендованным производителем антител (первичные поликлональые антитела к CREB; вторичные кроличьи антитела конъюгированные с HRP). На вестерн-блоте, полученном с помощью iBindTM, CREB был выявлен в 6 мкг клеточного экстракта, тогда как на блоте, сделанном вручную, он был выявлен только в 10 мкг экстракта. Для всех блотов белки разделяли на электрофоретической системе Bolt Gel Electroforetic System и переносили на PVDF-мембраны за 7 мин с помощью системы iBlot 7-Minute Blotting System.
Рисунок 2.
Вестерн-блоты, полученные с помощью системы iBindTM демонстрируют повышенную чувствительность по сравнению с вестерн-блотами, полученными традиционными методами. Вестерн-блоты, полученные разделением образцов на NuPAGETM 4-12% гелях с MOPS SDS буфером были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану с использованием системы iBlotTM 2 Dry Blotting System. Ячейки 1-5: 80-5 нг IKK beta; ячейки 6-10: 120-7.5 нг DDR2; ячейки 11-15: 40-2.5 нг FLT1; ячейки 16-20: 360-22.5 нг HCK. Белки были детектированы с помощью первичных антител кролика анти-GST и козьих вторичных анти-кроличьих антител. A) Вестерн-блот с использованием iBind технологии: 8 мкл первичного антитела, 6.7 мкл вторичного антитела, каждое из которых растворено в 4 мл iBind раствора. B) Вестерн блот, полученный вручную: 40 мкл первичного антитела, 33.3 мкл вторичного антитела, каждое из них растворено в 20 мл iBind раствора. После завершения процесса, блоты были инкубированы по 5 минут в SuperSignalTM West Dura субстрате. Изображения были получены с использованием системы ChemiDocTM (Bio-Rad).

Большая эффективность вестерн-блота по сравнению с традиционными методиками

  • Системы iBindTM обеспечивают повышенную чувствительность к моноклональным и поликлональным антителам по сравнению с традиционными методиками (Рисунок 1)
  • При использовании системы iBindTM в сочетании с высокоспецифичными первичными и вторичными антителами Novex, Вы получите чистые вестерн-блоты, на которых будет высвечиваться только необходимый Вам белок
  • Автоматизация процесса обеспечивает воспроизводимость результатов с коэффициентом вариации менее 5%, в то время как для традиционных методов он составляет 13%.

Выберите прибор, который подходит именно Вам: iBind Western Device или iBind Flex Western Device

  iBind Western Device iBind Flex Western Device
Mini blot (single) + +
Mini blot (dual) - +
Midi blot - +
вертикальные полоски - +

Экономьте свое время вместе с iBind Western Device или iBind Flex Western Device!

вестерн-блот проведенный традиционным методом:

вестерн-блот с технологией iBind:

Все, что потребуется для усовершенствования Вашего вестерн-блота

Товар количество Кат.номер
iBind TM Western Device   SLF1000
iBind TM Western Cards 10 SLF1010
iBind TM Solution Kit 1 kit SLF1020
Novex AP Mouse Chemiluminescent Detection Kit 1 kit SLF1021
Novex AP Rabbit Chemiluminescent Detection Kit 1 kit SLF1022
iBind TM Western Starter Kit   SLF1000S
iBind TM Western Device 4 Pack 4 SLF10004PK
Novex ECL Chemiluminescent Substrat Reagent Kit 1 kit WP20005
Novex Goat Anti-Rabbit (H+L), cross-adsorbed, HRP 1 mg A16072
Novex Goat Anti-Mouse (H+L), cross-adsorbed, HRP 1 mg A16104
iBind TM Flex Starter Kit 1 SLF2000S
iBind TM Flex Western Device 1 SLF2000
iBind TM Flex Cards (10/box) 1 SLF2010
iBind TM Flex FD Solution Kit 1 kit SLF2019
iBind TM Flex Solution Kit 1 kit SLF2020
iBind TM Western Device 1 SLF1000
iBind TM Window Cover 1 SLF1001
iBind TM Cards 10 SLF1010
iBind TM Fluorescent Detection (FD) Solution Kit 1 kit SLF1019
iBind TM Solution Kit 1 kit SLF1020

Высокоспецифичные и чувствительные первичные и вторичные антитела для Вашего вестерн-блота Вы сможете найти на thermofisher.com/antibodies

АНТИТЕЛА

Отправить запрос
* Содержание запроса:
* Название организации:

Подразделение/
кафедра/
лаборатория:

* Город(адрес):
* ФИО:
* E-mail:
Телефон:
Комментарий:
* Код: Введите код 

Отсылая данный запрос в компанию Химэксперт, Вы даете согласие на обработку Ваших персональных данных и их включение в базу данных в соответствии с законодательством Российской Федерации.

 
Обратная связь
* ФИО:
E-mail:
* Телефон:
* Сообщение: