Анализ мутаций в онкологии

Возникающие соматические мутации могут являться причиной появления злокачественных новообразований. 

Как правило, в основе появления новообразований лежит повреждение ДНК, вызываемое внутренними факторами (нарушением процессов репликации, репарации или рекомбинации) или внешними воздействиями (ионизирующей радиацией, химическими мутагенами или вирусами). Одним из результатов такого повреждения ДНК может оказаться появление клона клеток, обладающего дефектами регуляции клеточного размножения, что приводит к опухолевому росту.

Детекцию и идентификацию соматических мутаций проводят анализом образцов ткани опухолей, которые могут представлять собой ткань с предраковыми изменениями, опухолевую и другую ткань. Соматические мутации возникают в клетках опухоли, которые всегда окружены нормальной тканью.

Для исследования из образцов, полученных гистологическими методами, извлекается ДНК, которая содержит смесь ДНК из опухолевых и нормальных клеток.

В связи с тем, что образцы часто отличаются низким содержанием опухолевых клеток, методы детекции соматических мутаций должны обладать высокой аналитической чувствительностью для определения небольших (1-5%) количеств ДНК с мутацией на фоне ДНК дикого типа из нормальной ткани.

Исследования в области онкологии могут быть проведены несколькими методами, каждый из которых эффективен для достижения определенных целей:

Секвенирование по Сэнгеру

В большинстве исследований соматических мутаций используется метод секвенирования по Сэнгеру. Для проведения данного вида анализа идеальны генетические анализаторы серий 3500 и 3730 Applied Biosystems. Они позволяют выявлять такие типы мутаций как:

  • Однонуклеотидная замена
  • Малые дупликации, делеции, инсерции

Целый ряд мутаций (как однонуклеотидных замен, так и инделов) в определенных генах имеет прогностическое и предиктивное (в плане терапии) значение. Дело в том, что наличие определенных мутаций делает эффективность терапии некоторыми препаратами крайне низкой. Таким образом, тестирование на наличие определенных мутаций имеет важное, подчас ключевое, значение при выборе терапии для лечения рака. Например, такое значение имеют мутации в генах c-KIT, EGFR и KRAS. Поэтому использование наборов, позволяющих изучать мутации в этих генах, очень важно для клинической онкологии.

Имеются уже готовые наборы по поиску основных мутаций в генах, для которых показано наличие достоверной связи с эффективностью терапии лекарственными препаратами.

В частности SeqFinder Sequencing EGFR/KRAS/BRAF/ c-KIT Kit – готовые наборы для определения мутаций в онкогенах методом секвенирования:

Seqfinder BRCA 1-2 Whole Gene Sequencing Kit

Наиболее частой формой рака среди женщин европейской популяции является рак груди. Риск развития рака груди на одном из этапов жизни у женщин превышает 10% . При этом 5-10% случая рака груди носят наследственный характер, а мутантный аллель, приводящий к развитию рака груди является доминантным. Клинически значимыми генами являются гены BRCA1/BRCA2. Вследствие большого количества мутаций, разбросанных по данным генам, необходимо анализировать все кодирующие участки с прилегающими к ним участками сплайсинга. Это возможно сделать с помощью SeqFinder BRCA 1/BRCA2 Whole Gene Sequencing Kit.

Seqfinder BRCA 1-2 Whole Gene Sequencing Kit - набор реагентов для определения мутаций в генах BRCA1/BRCA2. При использовании набора нарабатывается 80 ПЦР продуктов, благодаря чему становится возможным секвенировать 100% кодирующих участков генов BRCA1/BRCA2.

  • (каталожный номер 110005 – 5 образцов)
  • (каталожный номер 110010 – 10 образцов)
  • (каталожный номер 110025 – 25 образцов)

Seqfinder EGFR Sequencing Kit

Набор для определения мутаций в гене EGFR. Мутации в этом гене часто связаны с раком легких. Так, препараты Gefitinib и Erlotinib эффективны при терапии рака у пациентов с мутацией EGFR, но они не имеют ингибирующего эффекта на опухоли, несущие мутацию T790M в гене EGFR. Поэтому выявление конкретных мутаций в гене EGFR, очень важно при выборе правильной терапии для пациента.

Набор содержит реактивы необходимые для секвенирования основных кодирующих участков гена EGFR.

  • (каталожный номер 108025 – 25 образцов)
  • (каталожный номер 108050 – 50 образцов)
  • (каталожный номер 108100 – 100 образцов)

Seqfinder KRAS Sequencing Kit

В более 30% случаев колоректального рака у больного обнаруживается мутация в гене KRAS. Мутации в кодонах 12, 13 и 61 – потенциальные биомаркеры рака легкого Детекция мутаций в гене KRAS рекомендована для прогноза эффективности лечения препаратами на основе моноклональных антител. Также наличие мутаций в гене KRAS приводит к крайне низкой эффективности препаратов Рanitumumab (Vectibix®) и Сetuximab (Erbitux®) при терапии колоректального рака.

  • (каталожный номер gml.kras.50 – 25 образцов)
  • (каталожный номер gml.kras.100 – 50 образцов)
  • (каталожный номер gml.kras.200 – 100 образцов)

Seqfinder BRAF Sequencing Kit

Набор для определения мутаций в гене BRAF. Наличие мутации BRAF V600Е, установленное с помощью молекулярно-генетического теста, является показанием к назначению препарата Vemurafenib (ингибитор мутантного BRAF), Zelboraf (Roche Products). В целом в гене BRAF обнаружено более 30 мутаций, связанных с разными формами рака. В зависимости о наличия той или иной мутации рекомендована разная терапия.

Набор содержит реактивы, необходимые для секвенирования 15 экзона гена BRAF. Это позволяет обнаружить все мутации в 600 и 601 кодонах. Чувствительность набора позволяет определять мутации в гене в присутствии 10% обладающих мутацией опухолевых клеток на фоне остальных 90%, лишенных этой мутации.

  • (каталожный номер 107025 – 25 образцов)
  • (каталожный номер 107050 – 50 образцов)
  • (каталожный номер 107100 – 100 образцов)

Если исследование подразумевает анализ не столь хорошо изученных генов, то подобрать праймеры для секвенирования нужных вам участков генома поможет бесплатный ресурс, расположенный на сайте производителя Thermo Fisher Scientific: "Primer Designer Tool for PCR & Sanger Sequencing". Он содержит все необходимое для того, чтобы подобрать для вас праймеры – исследователю остается лишь отправить компании Химэксперт ID его пары праймеров.

Однако, используя данный метод, нужно обращать внимание, что детекция мутации происходит только при ее содержании в образце более 20%, что может привести к ложноотрицательным результатам при меньшем содержании ДНК с мутацией в образце. В некоторых случаях эта проблема может быть решена с помощью макродиссекции опухолевой ткани для обогащения опухолевыми клетками, однако, в случае диффузного расположения опухолевых клеток выполнить макродиссекцию не представляется возможным.

Помочь в решении проблемы может использование программного обеспечения Minor Variant Finder, которое помогает эффективно выявлять низкочастотные соматические мутации (встречающиеся с частотой 5% и менее). Использование данного ПО поможет исследователю найти мутации в опухолевой ткани, даже если они встречаются с крайне низкой частотой.

Выделение НК из образцов для онкологических исследований

Recover AllTM Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE

Набор для ручного выделения геномной ДНК и/или микроРНК, общей РНК из образцов, фиксированных в формалине или парафине.

Преимущества набора:

  • Выделение происходит без инкубирования образца протеиназой К на 24 часа
  • Стартовый материал для высокого выхода– секции ткани до 20 мкм (< 35 мг)
  • Высокий выход – > 50% нефиксированной ткани, до 24 мкг ДНК
  • Быстрота выделения – 45 мин ручной работы
  • Эффективное высвобождение РНК из срезов, предотвращающее дальнейшую деградацию и модификацию РНК формальдегидом

(каталожный номер AM1975– 40 реакций)


MagMAXTM FFPE Total Nucleic Acid Isolation Kit

Набор для автоматического выделения на приборе MagMax Express геномной ДНК и/или микроРНК, общей РНК из образцов, фиксированных в формалине или парафине.

Преимущества набора:

  • Набор полностью укомплектован для выделения 96 образцов (избирательная сорбция на магнитных частицах)
  • Стартовый материал для высокого выхода – секции до 20 мкм (< 35 мг)
  • Высокий выход – не уступает специализированному ручному выделению
  • Объем элюции – 70 мкл, концентрирование
  • Быстрота выделения – 2,5 часа + 30 мин ручной работы
  • Эффективное высвобождение РНК из срезов, предотвращающее ее дальнейшую деградацию и модификацию формальдегидом за счет мягкой обработки протеиназой
  • Депарафинизация производится серией отмывок ксилолом и этанолом

Для выбора иного набора для выделения ДНК, подходящего под цели Вашего исследования пройдите по ссылке.

Провести автоматизированное выделение ДНК можно на следующих станциях для выделения ДНК:

MagMax Express -96

96 образцов за запуск. Объем образца ДНК/РНК 10-1000 мкл. Эффективность сбора частиц > 95%. Термостатируемый блок (4-96°С).

AutoMate Express

1-13 образцов за запуск. Инновационная колонка PrepFiler LySep для лизиса и извлечения сверхчистой ДНК. Время выделения 40 мин (120 мин для костной ткани). Закрытая система, снижающая риск загрязнения.

Принцип действия всех перечисленных станций основан на использовании технологии избирательной сорбции на магнитных частицах.

Промер концентрации выделенной ДНК для онкологических исследований

Для промера низких концентраций ДНК, РНК и белка лучшего всего воспользоваться высокочувствительным прибором нового поколения Qubit 3.0.

Сложные образцы (образцы в онкодиагностике), дорогостоящие реагенты, зависимость результата от точности промеренной концентрации вещества, экономия времени и финансовых затрат – все это свидетельствует в пользу использования Qubit 3.0.

Отправить запрос
* Содержание запроса:
* Название организации:

Подразделение/
кафедра/
лаборатория:

* Город(адрес):
* ФИО:
* E-mail:
Телефон:
Комментарий:
* Код: Введите код 

Отсылая данный запрос в компанию Химэксперт, Вы даете согласие на обработку Ваших персональных данных и их включение в базу данных в соответствии с законодательством Российской Федерации.

 
Обратная связь
* ФИО:
E-mail:
* Телефон:
* Сообщение: