Валидирование данных полученных на платформах секвенирования следующего поколения (NGS)

Валидирование данных полученных на платформах секвенирования следующего поколения.

Секвенирование по Сэнгеру по-прежнему остается золотым стандартом секвенирования во всем мире. И хотя технологии следующего поколения, несомненно, являются более высокопроизводительными, новые мутации, обнаруженные при их использовании, как правило, должны быть подтверждены секвенированием по Сэнгеру. Подтверждение необходимо для того, чтобы убедиться, что это действительно мутация, а не ошибка секвенирования. В настоящий момент секвенирование по Сэнгеру остается наиболее точной технологией секвенирования. Именно поэтому и рекомендована валидация данных NGS методом секвенирования по Сэнгеру.

Провести валидирование можно на генетических анализаторах серий 3500 и 3730 Applied Biosystems и на более ранних версиях генетических анализаторов Applied Biosystems.

Для проведения валидации понадобятся следующие реактивы:

Набор для постановки ПЦР, проведения реакции секвенирования и очистки продукта ПЦР реакции - BigDye® Direct Cycle Sequencing Kit

Форматы:

  • 24 реакции – каталожный номер 4458689;
  • 100 реакций – каталожный номер 4458687;
  • 1000 реакций – каталожный номер 4458688.

Буфер для постановки реакции секвенирования - BigDye® Terminator v1.1 & v3.1 5X Sequencing Buffer (нужен при использовании набора BigDye® Terminator v3.1)

Форматы буфера для наборов реагентов v1.1 и v3.1:

  • 1 мл – каталожный номер 4336697;
  • 25 мл – каталожный номер 4336699;
  • 230 мл – каталожный номер 4336701.

Форматы буфера для наборов реагентов v1.0 и v3.0:

  • 600 реакций – каталожный номер 4305605;
  • 5400 реакций – каталожный номер 4305603.

Набор для постановки реакции секвенирования - BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

  • 24 реакции – каталожный номер 4337454;
  • 100 реакций – каталожный номер 4337455;
  • 1000 реакций – каталожный номер 4337456;
  • 5000 реакций – каталожный номер 4337457.

В каждый набор реагентов входит 5-ти кратный буфер для секвенирования ДНК.

Сиквенсный стандарт для проведения секвенирования - 3500/3500xL Sequencing Standards, BigDye® Terminator v3.1 (каталожный номер 4404312).

Матричный стандарт (31xx Matrix Standards Kit, BigDye® Terminator v3.1), совместим с генетическими анализаторами 3100, 3100-AvantTM, 3130, 3130xl, 3500 and 3500xl. (каталожный номер 4336974).

BigDye XTerminator®

Данный набор реагентов предназначен для быстрой и полной очистки сиквенсной реакции от лишних (не связанных) BigDye-терминаторов. В набор входят два реагента, которые могут быть добавлены последовательно или заранее перемешаны: XTerminatorTM Solution – связывает лишние BigDye-терминаторы и свободные соли; SAMTM Solution – усиливает эффективность XTerminatorTM Solution и стабилизирует реакцию.

Преимущества:

  • Реакция очистки осуществляется за 40 минут;
  • Простой протокол;
  • Отсутствие возможных потерь образца;
  • Более высокое качество результатов секвенирования;
  • Реакция проходит в планшете, которая затем загружается в генетический анализатор;
  • Стабилизация образцов перед анализом;
  • Возможность повторного проведения электрофореза без повторного проведения реакции очистки (планшеты с образцами и данными реагентами могут храниться в течение 48 часов при комнатной температуре или 10 дней при 4 °C);
  • Наличие в генетических анализаторах встроенного модуля для проведения электрофореза с данными реагентами;
  • Возможность выполнения очистки вручную или автоматизировано;
  • Получение надежных и воспроизводимых результатов.

Форматы:

  • 2 мл (100 реакций) – каталожный номер 4376486;
  • 20 мл (1000 реакций) – каталожный номер 4376487;
  • 50 мл (2500 реакций) – каталожный номер 4376484;
  • 800 мл – каталожный номер 4376485.

Для очистки продукта реакции секвенирования используйте следующие наборы:

GML Spin Purification Columns с наполнителем Sephadex.

Колонки работают на основе метода гель-фильтрации, с использованием вещества Sephadex - наполнителя для колонок, микропористого материала, представляющего собой декстран, молекулы которого соединены химическими связями. Sephadex является сорбентом, используемым для удаления избытка флуоресцетно-меченных терминаторов, а также солей после реакции секвенирования.

В ходе реакции секвенирования расходуются не все флуоресцентно меченые терминаторы. Неиспользованные движутся совместно с целевыми фрагментами ДНК по капилляру, приводят к формированию «пятен от краски» и ошибкам «basecalling». Соли, присутствующие в реакционной смеси конкурируют с целевыми фрагментами ДНК во время электрокинетической инъекции, что, в свою очередь, понижает уровень сигнала. Использование очистки на колонках позволяет избежать этих явлений.

GML Purification Columns (200 колонок) – каталожный номер 301200;

Sephadex, 20 грамм (достаточно для 400 очисток) – каталожный номер S602220;

Centri-SepTM Spin Columns

Centri-SepTM Spin Columns используются для быстрой и эффективной очистки нуклеиновых кислот. The Centri-SepTM очистить фрагменты размером больше 16 п.о., удаляя при этом до 98% солей, нуклеозидтрифосфатов и других низкомолекулярных соединений. Преимущества этих колонок в следующем:

  • быстрое и эффективное очищение НК
  • подходят для работы с 20-200 мкл образца
  • возможно использование с пользовательским буфером
  • имеют микроцентрифужный формат

Форматы:

  • 100 колонок – каталожный номер 401762
  • 32 колонки – каталожный номер 401763

Centri-SepTM 96-Well Plates

Использование Centri-SepTM 96 луночных планшет является быстрым и эффективным способом удаления избытка BigDye® терминаторов из продукта сиквенсовой реакции. Использование таких планшет позволяет производить очистку вручную или с помощью роботизированной станции в течение 15 минут. Очищенный таким способом продукт реакции позволит Вам получить чистые и ясные сиквенсы.

Преимущества этих планшет в следующем:

  • быстрое и эффективное очищение НК
  • подходят для работы с 20-200 мкл образца
  • возможно использование с пользовательским буфером
  • имеют микроцентрифужный формат

Форматы:

  • 2 планшеты – каталожный номер 4367819
  • 50 планшет – каталожный номер 4367821

Centri-SepTM 8-Well Strips

Centri-SepTM стрипы позволяют Вам одновременно проводить очистку для стольких стрипов продукта реакции, для скольких Вам это требуется. Centri-SepTM стрипы являются быстрым и эффективным способом удаления избытка BigDye® терминаторов, низкомолекулярных соединений, солей и избытка праймеров из продукта сиквенсовой реакции.

Формат:

12 стрипов – каталожный номер 4367820

Отправить запрос
* Содержание запроса:
* Название организации:

Подразделение/
кафедра/
лаборатория:

* Город(адрес):
* ФИО:
* E-mail:
Телефон:
Комментарий:
* Код: Введите код 

Отсылая данный запрос в компанию Химэксперт, Вы даете согласие на обработку Ваших персональных данных и их включение в базу данных в соответствии с законодательством Российской Федерации.

 
Обратная связь
* ФИО:
E-mail:
* Телефон:
* Сообщение: