Анализ протяженных делеций

Изменения структурных генов, вызванные протяженными делециями, встречаются сравнительно редко, но описаны при многих наследственных болезнях. Частота таких мутаций заметно отличается среди разных генетических заболеваний; некоторые характеризуются высокой частотой обнаруживаемых делеции, при других делеции бывают редкой причиной мутации. Например, делеции большого гена дистрофина в Х-хромосоме при мышечной дистрофии Дюшенна или большого гена нейрофибромина при нейрофиброматозе I типа присутствуют более чем в 60% случаев. В некоторых случаях причина делеции гена хорошо известна и связана с нарушением рекомбинации между многочисленными копиями аналогичных или идентичных последовательностей ДНК. В других случаях причины делеции неизвестны.

Также делеции могут являться причиной новообразования злокачественных опухолей, приводя к потере к гетерозиготности. Потеря гетерозиготности - частое событие, происходящее в опухоли. Оно может быть вызвано делецией участка или полной потерей хромосомы. Согласно двухударной модели канцерогенеза, предполагается, что для перехода нормальной клетки в опухолевую необходимо два последовательных мутационных события. Первым событием является мутация, приводящая к образованию клетки, которая обладает повышенным риском возникновения опухоли. Вторым событием, является потеря гетерозиготности гена и, затем, превращение клетки в злокачественную.

Таким образом, обнаружение делеций очень важно для диагностики и правильной постановки диагноза. Для детекции инсерций и делеций часто используются такие методики, как Саузерн блот, FISH анализ. Однако они требуют высокой концентрации ДНК, больших затрат времени. Эффективным методом обнаружения протяженных делеций является секвенирование следующего поколения. Однако этот метод доступен не всем исследователям.

Поэтому самым удобным способом определения протяженных мутаций является количественная флуоресцентная ПЦР с детекцией методом капиллярного электрофореза.

С его использованием анализ делеций можно провести тремя способами:

фрагментным анализом

Этот метод основан на амплификации ДНК, когда используют один флуоресцентно меченый праймер и один флуоресцентно немеченый праймер для каждого анализируемого участка гена, экзона. Помимо образцов с делециями для проведения эксперимента используют контрольную ДНК. Наличие делеций регистрируют путем сравнения с контролем, по появлению продуктов амплификации необычного размера.

Заказать пару меченый и немеченый праймер нужной последовательности для проведения фрагментного анализа, Вы можете по ссылке.

Для анализа делеций ставится 2 реакции амплификации – одна для ДНК из клеток из нормальной ткани, другая – для ДНК из ткани, в которой подозревается наличие делеций. Здоровый человек имеет на фореграмме 2 пика, соответствующих 2 аллелям без делеций. При наличии делеции, один пик будет меньше высотой.

технологией SNaPshot
MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification

MLPA или Мультиплексная амплификация лигазно-связанных проб имеет следующие преимущества:

  • для постановки ПЦР используется только одна пара праймеров
  • позволяет различить последовательности, отличающиеся всего на один нуклеотид
  • требует небольшого количества ДНК (20 нг или 3000 клеток)
  • может использоваться, в том числе, и для анализа сильно деградированной ДНК (выделенной из образцов, фиксированных в формалине или парафине)

Как работает MLPA

Если последовательность, комплементарная зонду для MLPA, присутствует в образце, то оба олигонуклеотида гибридизуются друг за другом. Гибридизованные олигонуклеотиды сшивает лигаза. В результате чего лигированные олигонуклеотиды совместно амплифицируются в ПЦР. Происходит амплификация не нуклеиновых кислот образца, а зонда. Каждый зонд образует продукт амплификации уникальной длины. Продукты амплификации анализируют методом капиллярного электрофореза.

Протяженными делециями можно считать и анеуплоидию – полную потерю одной из хромосом. Разработанные, коммерчески доступные наборы для анализа анеуплоидий можно найти по ссылке.

С использованием программного обеспечения GeneMapper (Applied Biosystems) Вы сможете в автоматическом режиме обрабатывать полученные данные. Подробное описание, как это сделать смотрите в файле (Detection of Large Deletions or Duplications).

Отправить запрос
* Содержание запроса:
* Название организации:

Подразделение/
кафедра/
лаборатория:

* Город(адрес):
* ФИО:
* E-mail:
Телефон:
Комментарий:
* Код: Введите код 

Отсылая данный запрос в компанию Химэксперт, Вы даете согласие на обработку Ваших персональных данных и их включение в базу данных в соответствии с законодательством Российской Федерации.

 
Обратная связь
* ФИО:
E-mail:
* Телефон:
* Сообщение: